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Diplomarbeit aus dem Jahr 2001 im Fachbereich Medizin - Biomedizinische Technik, Note: 1,7, Technische Universität Berlin (Prozeßwissenschaften), Sprache: Deutsch, Abstract: Inhaltsangabe:Zusammenfassung:
Bluthochdruck, ein wichtiger Risikofaktor für Herz-Kreislauferkrankungen, betrifft etwa 15-20% der Bevölkerung in westlichen Industrienationen. Abgesehen von seltenen monogenetischen Formen wird er in über 90% der Fälle durch die Wechselwirkung von mehreren, bisher weitgehend unbekannten Genen untereinander und mit Umweltfaktoren ausgelöst.
Ein mit Bluthochdruck assoziierter QTL (quantitative trait locus) wurde in der Ratte auf Chromosom 10 gefunden und BP/SP1 bezeichnet (blood pressure/stroke prone). Diese Region ist evolutionär offenbar stark konserviert und findet sich auch beim Menschen auf Chromosom 17, wo ebenfalls eine Assoziation mit Bluthochdruck nachgewiesen wurde. Durch die Etablierung von congenen Linien konnte BP/SP1 in zwei kleinere QTLs, BP/SP1a und BP/SP1b, unterteilt werden, von denen durch IRS-PCR walking (interspersed repetitive sequence) YAC -Klon Contigs bereits konstruiert wurden.
In der vorliegenden Diplomarbeit wurde eine Feinkartierung beider QTLs durch PAC-Klone durchgeführt, d.h. es sollten korrespondierende PACs zu den YAC-Klonen der BP/SP1a und b Contigs gefunden werden. Dazu wurden 37 YAC-Klone aus den BP/SP1a und b Contigs gegen jeweils zwei Hochdichtefilter der PAC-Bibliothek Rat PAC mit 27648 Klonen pro Filter hybridisiert, was etwa zwei Genomäquivalenten pro YAC entspricht.
251 PACs konnten so identifiziert werden. Bei einer anschließenden IRS-PCR lieferten 37,1% der Klone (93 PACs) IRS-PCR-Produkte, die zur Radiation-Hybrid (RH)-Kartierung sowie zur Kartierung über korrespondierende YACs herangezogen wurden.
50 PAC-Klone konnten durch RH-Mapping kartiert werden, davon 33 Klone auf Chromosom 10. Die anderen 17 verteilen sich auf die Chromosomen 1, 6, 7, 11, 12, 13, 15 und 20.
Für 66 PACs konnten durch Hybridisierung gegen YAC-Pool-Filter der beiden Bibliotheken Rat YAC und WI/MIT Rat YAC mit zusammen 20 Genomäquivalenten korrespondierende YACs bestimmt werden, wobei pro Filter zwischen 2 und 15 YACs getroffen wurden. 17 dieser 66 PACs konnten zusätzlich auch RH-kartiert werden.
Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis:
Zusammenfassung7
Abkürzungsverzeichnis8
1Einleitung9
1.1Projektschema der Diplomarbeit9
1.2Bluthochdruck10
1.3Die Ratte als Tiermodell für die Erforschung komplexer genetischer Erkrankungen11
1.4Die Identifizierung von Genen14
1.4.1Kartierung des BP/SP1 Intervalls14
1.4.2Congene Rattenlinien16
1.5Die positionelle Klonierung (Positional Cloning)18
1.5.1Das Kandidatengen Verfahren zur Genisolierung19
1.6Vektoren zur DNA-Klonierung20
1.6.1Das YAC-System (Yeast Artificial Chromosome)20
1.6.2PAC und BAC Klone als Alternativen zu YACs21
1.7Genomische Bibliothekenund Ressourcen der Ratte21
1.7.1YAC-Bibliotheken21
1.7.2PAC-Bibliothek23
1.8RH-Panel26
1.8.1Radiation-Hybrid Karte der Ratte27
1.9Genetische Kartierung28
1.10Physikalische Kartierung29
1.11IRS-PCR (Interspersed Repetitive Sequence-PCR)30
1.12Problemstellung und Zielsetzung32
2Material33
2.1Chemikalien33
2.2Enzyme33
2.3Radioaktive Isotope33
2.4Medien und Lösungen33
2.4.1Medien34
2.4.2Lösungen34
2.5DNA - Längenmarker36
2.6Geräte und Zubehör36
3Methoden37
3.1Präparation von genomischer Ratten DNA mittels Phenol / Chloroform Extraktion37
3.1.1Scheren von genomischer DNA durch Ultraschall37
3.1.2Bestimmung der DNA-Konzentration37
3.1.3Isolierung von YAC DNA in Agarose-Plugs38
3.1.4Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE)38
3.1.5Blotten eines Pulsfeldgels39
3.1.5.1Markierung von genomischer Ratten DNA mit (-32...
Bluthochdruck, ein wichtiger Risikofaktor für Herz-Kreislauferkrankungen, betrifft etwa 15-20% der Bevölkerung in westlichen Industrienationen. Abgesehen von seltenen monogenetischen Formen wird er in über 90% der Fälle durch die Wechselwirkung von mehreren, bisher weitgehend unbekannten Genen untereinander und mit Umweltfaktoren ausgelöst.
Ein mit Bluthochdruck assoziierter QTL (quantitative trait locus) wurde in der Ratte auf Chromosom 10 gefunden und BP/SP1 bezeichnet (blood pressure/stroke prone). Diese Region ist evolutionär offenbar stark konserviert und findet sich auch beim Menschen auf Chromosom 17, wo ebenfalls eine Assoziation mit Bluthochdruck nachgewiesen wurde. Durch die Etablierung von congenen Linien konnte BP/SP1 in zwei kleinere QTLs, BP/SP1a und BP/SP1b, unterteilt werden, von denen durch IRS-PCR walking (interspersed repetitive sequence) YAC -Klon Contigs bereits konstruiert wurden.
In der vorliegenden Diplomarbeit wurde eine Feinkartierung beider QTLs durch PAC-Klone durchgeführt, d.h. es sollten korrespondierende PACs zu den YAC-Klonen der BP/SP1a und b Contigs gefunden werden. Dazu wurden 37 YAC-Klone aus den BP/SP1a und b Contigs gegen jeweils zwei Hochdichtefilter der PAC-Bibliothek Rat PAC mit 27648 Klonen pro Filter hybridisiert, was etwa zwei Genomäquivalenten pro YAC entspricht.
251 PACs konnten so identifiziert werden. Bei einer anschließenden IRS-PCR lieferten 37,1% der Klone (93 PACs) IRS-PCR-Produkte, die zur Radiation-Hybrid (RH)-Kartierung sowie zur Kartierung über korrespondierende YACs herangezogen wurden.
50 PAC-Klone konnten durch RH-Mapping kartiert werden, davon 33 Klone auf Chromosom 10. Die anderen 17 verteilen sich auf die Chromosomen 1, 6, 7, 11, 12, 13, 15 und 20.
Für 66 PACs konnten durch Hybridisierung gegen YAC-Pool-Filter der beiden Bibliotheken Rat YAC und WI/MIT Rat YAC mit zusammen 20 Genomäquivalenten korrespondierende YACs bestimmt werden, wobei pro Filter zwischen 2 und 15 YACs getroffen wurden. 17 dieser 66 PACs konnten zusätzlich auch RH-kartiert werden.
Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis:
Zusammenfassung7
Abkürzungsverzeichnis8
1Einleitung9
1.1Projektschema der Diplomarbeit9
1.2Bluthochdruck10
1.3Die Ratte als Tiermodell für die Erforschung komplexer genetischer Erkrankungen11
1.4Die Identifizierung von Genen14
1.4.1Kartierung des BP/SP1 Intervalls14
1.4.2Congene Rattenlinien16
1.5Die positionelle Klonierung (Positional Cloning)18
1.5.1Das Kandidatengen Verfahren zur Genisolierung19
1.6Vektoren zur DNA-Klonierung20
1.6.1Das YAC-System (Yeast Artificial Chromosome)20
1.6.2PAC und BAC Klone als Alternativen zu YACs21
1.7Genomische Bibliothekenund Ressourcen der Ratte21
1.7.1YAC-Bibliotheken21
1.7.2PAC-Bibliothek23
1.8RH-Panel26
1.8.1Radiation-Hybrid Karte der Ratte27
1.9Genetische Kartierung28
1.10Physikalische Kartierung29
1.11IRS-PCR (Interspersed Repetitive Sequence-PCR)30
1.12Problemstellung und Zielsetzung32
2Material33
2.1Chemikalien33
2.2Enzyme33
2.3Radioaktive Isotope33
2.4Medien und Lösungen33
2.4.1Medien34
2.4.2Lösungen34
2.5DNA - Längenmarker36
2.6Geräte und Zubehör36
3Methoden37
3.1Präparation von genomischer Ratten DNA mittels Phenol / Chloroform Extraktion37
3.1.1Scheren von genomischer DNA durch Ultraschall37
3.1.2Bestimmung der DNA-Konzentration37
3.1.3Isolierung von YAC DNA in Agarose-Plugs38
3.1.4Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE)38
3.1.5Blotten eines Pulsfeldgels39
3.1.5.1Markierung von genomischer Ratten DNA mit (-32...