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Compreender a hepatotoxicidade dos medicamentos é essencial para o progresso da pesquisa acadêmica e industrial. O estudo da hepatotoxicidade in vitro é desafiador porque os hepatócitos, as células metabolicamente ativas do fígado, são muito difíceis de manter em cultura. Foi observado que a cultura de hepatócitos entre duas camadas de colágeno mantém a morfologia in vivo e também muitas enzimas de metabolização de drogas por semanas. Apesar de pesquisas que examinam o metabolismo de drogas em sanduíches de colágeno, há poucos dados sobre a aplicabilidade desse sistema em estudos de hepatotoxicidade. Nós cultivamos hepatócitos primários de rato na configuração de sanduíche de colágeno e otimizamos este sistema para estudos de hepatotoxicidade de longo prazo. Além disso, também examinamos o meio condicionado dos hepatócitos para investigar o perfil de proteína secretada, que poderia ser potencialmente usado para encontrar biomarcadores de toxicidade. Nossa análise proteômica combinou eletroforese em gel com Qstar LC-MS / MS, e fomos capazes de identificar 493 proteínas. Em resumo, mostramos que o sanduíche de colágeno é um sistema adequado para estudos de hepatotoxicidade e também para análises proteômicas.