Stressantwort von Mikroorganismen (eBook, PDF)
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Die Untersuchung der zellulären Stressantwort wird auf mehreren Ebenen durchgeführt, wozu die Genom-, Proteom- als auch die Metabolomebene gehöhren. Die Metabolom-ebene liefert dabei einen Einblick über die Vorgänge in den Zellen und zwar über die Art und Weise wie die metabolischen Flüsse in der Zelle umgeleitet werden um auf einen äußeren Faktor zu reagieren. Das Wissen über diese Zellantwort hilft größere Zusammenhänge in den Zellen zu verstehen und für eine gezielte Veränderung der Mikroorganismen einzusetzen, z. B. für eine verbesserte Proteinproduktion.
Die Untersuch...
Die Untersuchung der zellulären Stressantwort wird auf mehreren Ebenen durchgeführt, wozu die Genom-, Proteom- als auch die Metabolomebene gehöhren. Die Metabolom-ebene liefert dabei einen Einblick über die Vorgänge in den Zellen und zwar über die Art und Weise wie die metabolischen Flüsse in der Zelle umgeleitet werden um auf einen äußeren Faktor zu reagieren. Das Wissen über diese Zellantwort hilft größere Zusammenhänge in den Zellen zu verstehen und für eine gezielte Veränderung der Mikroorganismen einzusetzen, z. B. für eine verbesserte Proteinproduktion.
Die Untersuchung der intrazellulären Metabolite in den Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt der Kultivierung bedarf eines raschen Abstoppens der zellulären Vorgänge. Dazu werden im Allgemeinen kalte Lösungen, sog. Quenchinglösungen, zumeist basierend auf dem organischen Lösungsmittel Methanol, herangezogen. Der Abstoppprozess (engl. quenching) führt in allen bisher untersuchten Fällen zum Verlust von intrazellulären Metaboliten wie ATP. Die Auswirkung der Lösungen auf die Integrität der Zellen wurden in der vorgelegten Arbeit untersucht. Als Organismen wurden Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae eingesetzt. Untersucht wurden sowohl die Auswirkungen von unterschiedlichen Starttemperaturen der Abstopplösung als auch die Wirkung von verschiedenen Zusammensetzungen. Etabliert und eingesetzt wurde dazu die Durchflusszytometrie zur Bestimmung der beschädigten Zellpopulationsanteile, der Vergleich der optischen Dichte vor und nach der Behandlung (Indikator für Zellyse), sowie die Bestimmung eines repräsentativen Metabolits (ATP) in Abstopplösungsüberstand und Zellextrakt.
Mit der Abstopplösung die den geringsten Effekt auf die Zellen hat, wurde anschließend die Langzeitstressantwort von S. cerevisiae und einiger ausgewählter Knockoutmutanten (mae1Δ, zwf1Δ) untersucht. Die Kultivierung erfolgte in Schüttelkolben, wobei das Minimalmedium mit den ausgewählten Stressfaktoren Diamid (oxidativer Stress) oder Koffein versetzt wurde. Über Metabolic Profiling wurden die Zellextrakte mittels GC-MS analysiert. Dabei stellte sich heraus, dass Diamid in der eingesetzten Konzentration keinen Langzeiteffekt auf den Zellmetabolismus hatte. Jedoch störte Koffein die Zellen stark, was sich in einem deutlich verminderten Zellwachstum, veränderten Aminosäure- und geringeren Fettsäurekonzentrationen, sowie in der Produktion von kompatiblen Soluten äußerte.
Für die Untersuchung der dynamischen Stressantwort (d. h. Aufgabe eines Pulses) wurde ein automatisiertes Probenentnahmesystem für Glasreaktoren entwickelt (rapid sampling), mit dem Ziel, bei kontinuierlich betriebenem Bioreaktreaktor eingesetzt zu werden. Das System ermöglicht die Unterteilung eines kontinuierlichen Probenflusses in einzelne Proben, die jeweils eine Zeitspanne von ca. 143 ms abdecken.
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