Prozess- und Proteomanalyse gestresster Mikroorganismen (eBook, PDF)
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In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Temperatur, des mechanischen Stresses und die Produktion rekombinanter Proteine auf Mikroorganismen auf Prozess- und Proteomebene analysiert. Diese Stressfaktoren wurden im Zusammenhang mit der stationären Escherichia coli Hitzeschockantwort in einer kontinuierlichen Reaktorkaskade sowie während der heterologen Produktion eines Antikörperfragmentes in Bacillus megaterium untersucht.
Im ersten Projekt ermöglichte es die Versuchsanordnung einer Reaktorkaskade, E. coli-Zellen einem konstanten, definierten Temperaturstress bei einer konsta...
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Temperatur, des mechanischen Stresses und die Produktion rekombinanter Proteine auf Mikroorganismen auf Prozess- und Proteomebene analysiert. Diese Stressfaktoren wurden im Zusammenhang mit der stationären Escherichia coli Hitzeschockantwort in einer kontinuierlichen Reaktorkaskade sowie während der heterologen Produktion eines Antikörperfragmentes in Bacillus megaterium untersucht.
Im ersten Projekt ermöglichte es die Versuchsanordnung einer Reaktorkaskade, E. coli-Zellen einem konstanten, definierten Temperaturstress bei einer konstanten Durchflussrate auszusetzen. Die Proteomanalyse zeigte neben der verstärkten Expression von Chaperonen und Proteasen einen aufgrund der höheren Temperatur verursachten oxidativen Stress. Die Aminosäurebiosynthese sowie Enzyme des Zentralstoffwechsels wurden ebenso verstärkt gebildet wie Proteine, die an der alternativen Substrataufnahme aus dem umgebenden Medium beteiligt sind.
Im zweiten Projekt konnte die Analyse und Optimierung der heterologen Antikörperfragmentproduktion in B. megaterium zeigen, dass neben der Temperatur sich vor allem der mechanische Stress signifikant auf die Produktivität sowie auf die Zellgröße, die Aktivität und das Wachstum auswirkten. Die Proteomanalyse des heterologen Produktionsstresses zeigte die verstärkte Expression von Proteasen, einem Chaperon sowie Proteinen der Aminosäurebiosynthese und den verstärkten Transport von Peptiden aus dem Medium. Der mechanische Stress führte zum Induktionszeitpunkt zu einem höheren oxidativen Stress und höheren Expressionslevel der Protease ClpP und des Chaperons GrpE. In der Produktionsphase konnte bei einer geringeren mechanischen Belastung die verstärkte Expression des OppA-Proteins, das an der Aufnahme von Peptiden beteiligt ist, sowie Chaperonaktivität besitzt, beobachtet werden. In dieser Arbeit wurde deutlich, dass die detaillierte Analyse des Einflusses verschiedener Stressfaktoren auf Bakterienzellen viele Möglichkeiten aufzeigen kann, biotechnologische Prozesse auf Basis der Proteomanalyse zu optimieren.
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