Funktionelle Untersuchungen und Festkörper-NMR-Strukturanalyse am Fusionspeptid des HIV-1 (eBook, PDF)
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Im Rahmen dieser Arbeit sollte aus den Ergebnissen von verschiedenen Festkörper-NMR-Messungen ein Strukturmodell des FP23 in der Membran der Zielzelle erstellt werden und daraus resultierende Hinweise für den Fusionsmechanismus abgeleitet werden. Hierfür wurden der Wildtyp, sowie mehrere – mit unnatürlichen Aminosäuren als NMR-Sonden – an geeigneter Position markierte Varianten des Fusionspeptids (FP23) des Proteins gp41 aus HIV-1 mit 23 Aminosäureresten mittels Festphasenpeptidsynthese in ausreichender Menge und Reinheit hergestellt. Diese wurden mittels RP-HPLC charakteri...
Im Rahmen dieser Arbeit sollte aus den Ergebnissen von verschiedenen Festkörper-NMR-Messungen ein Strukturmodell des FP23 in der Membran der Zielzelle erstellt werden und daraus resultierende Hinweise für den Fusionsmechanismus abgeleitet werden. Hierfür wurden der Wildtyp, sowie mehrere – mit unnatürlichen Aminosäuren als NMR-Sonden – an geeigneter Position markierte Varianten des Fusionspeptids (FP23) des Proteins gp41 aus HIV-1 mit 23 Aminosäureresten mittels Festphasenpeptidsynthese in ausreichender Menge und Reinheit hergestellt. Diese wurden mittels RP-HPLC charakterisiert und aufgereinigt, sowie die bei der Synthese erhaltenen Peptidepimere voneinander getrennt. Die absolute Konfiguration der Peptidepimere wurde mittels stereospezifischer enzymatischer Umsetzung des razemischen 4-CF3-Phenylglycins, saurer Hydrolyse der Peptidepimere und anschließender Derivatisierung mit Marfeys Reagenz erstmals eindeutig bestimmt. Die strukturellen Eigenschaften der Peptide in Lösung wurden mittels CDSpektroskopie untersucht. Eine Störung der Peptidstruktur durch den Einbau von 4-CF3-Phg wurde nicht nachgewiesen. Die fusogene Aktivität der Peptide wurde mittels eines Lipid-Mixing-Assays an Lipidvesikeln, basierend auf Fluoreszenz- Resonanz-Energie-Transfer, überprüft. Mit Hilfe einer alternativen Methode, der dynamischen Lichtstreuung, wurde die fusogene Aktivität der Peptide bestätigt. Eingehende strukturelle Untersuchungen der Peptide in orientierten Lipidbilayern, welche die Zellmembran der Viruszielzelle imitieren, wurden mittels 31P-, 2H- und 19F-Festkörper-NMR-Messungen in orientierten Membranen durchgeführt. Mit den hierbei gewonnenen Informationen wurde mit zwei verschiedenen Methoden eine Analyse der Sekundärstruktur des FP23 in Lipidbilayern durchgeführt. Daraus wurde ein Strukturmodell des FP23 in einer Lipiddoppelschicht erstellt.
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