ErbB3-defiziente Mäuse als System für die Analyse der Differenzierung und Migration von Schwannzellen (eBook, PDF)
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Im Rahmen dieser Arbeit sollten Informationen über das Differenzierungs- und Migrationsverhalten von Schwannzell-Vorläufern erhalten werden. ErbB3-defiziente Mäuse zeichnen sich aufgrund eines Differenzierungs- und Migrationsdefektes durch einen kompletten Verlust der Schwannzellen entlang der Axone aus und wurden daher als Basis für die hier durchgeführten Analysen ausgewählt, in deren Mittelpunkt die Identifizierung von Genen stand, die in den entsprechenden Differenzierungs- und Migrationsprozessen involviert sind. Die Analyse der differenziellen Genexpression erfolgte unter Verwendun...
Im Rahmen dieser Arbeit sollten Informationen über das Differenzierungs- und Migrationsverhalten von Schwannzell-Vorläufern erhalten werden. ErbB3-defiziente Mäuse zeichnen sich aufgrund eines Differenzierungs- und Migrationsdefektes durch einen kompletten Verlust der Schwannzellen entlang der Axone aus und wurden daher als Basis für die hier durchgeführten Analysen ausgewählt, in deren Mittelpunkt die Identifizierung von Genen stand, die in den entsprechenden Differenzierungs- und Migrationsprozessen involviert sind. Die Analyse der differenziellen Genexpression erfolgte unter Verwendung von dorsalen Spinalganglien von Wildtyp und ErbB3-defizienten Embryonen. Hierfür wurden DRG des Embryonaltages 12,5 isoliert und das Einsetzen der Auswanderung der Schwann-zell-Vorläufer entlang der Axone durch in vitro-Explant?Kultur zeitlich definiert.Aus diesen Kulturen wurde die gesamte RNA unter Verwendung unterschiedlicher Techniken amplifiziert, um ausreichende Mengen qualitativ hochwertiger RNA Populationen zu erhalten, die den jeweiligen transkriptionellen Status der DRG repräsentieren. Dabei wurden Varianten der PCR zur Anreicherung vollständiger Transkripte sowie in vitro-Transkriptionsverfahren genutzt. Anschließend wurde die so erhaltene DNA bzw. RNA der differenziellen Genanalyse unterworfen. Mittels Subtraktiver Hybridisierung wurden vier unterschiedliche Gene identifiziert, von denen nur für eines differenzielle Expression bestätigt werden konnte. Die differenzielle Analyse mittels der „DNA?Micro-Array“-Technologie resultierte in der Identifizierung von nahezu 200 signifikant differenziell exprimierten Genen, von denen 25% der Organisation der extrazellulären Matrix zugerechnet werden können. Gene, die bekanntermaßen in den verwendeten System exprimiert sind, konnten hier die Validität der Ergebnisse bestätigen. Sowohl im Rahmen der Subtraktiven Hybridisierung als auch der „DNA?Micro-Array“- Technologie wurde Periostin als das Gen, dass eine signifikant höhere Expression in Wildtyp-DRG im Vergleich zu DRG von ErbB3-defizienten Embryonen aufzeigt, identifiziert. Da den Proteinen der extrazellulären Matrix während dieser Phase der Schwannzell?Entwicklung eine hohe Bedeutung zuzukommen scheint, wurde die Expression Periostins genauer charakterisiert und zunächst mittels Virtuellen Northern Blots und der „Real?Time-PCR“ die differenzielle Expression Periostins bestätigt sowie das Ausmaß der Differenz quantifiziert.Periostin ist ein Protein von 838 Aminosäuren mit einer typischen Signalsequenz und beinhaltet 4 Fasciclin I?artige Domänen. Bislang konnten 4 Isoformen, die sich C?terminal unterscheiden, identifiziert werden. Mittels durchgeführten 3’-RACE Analysen konnte die Expression zweier dieser Isoformen in den DRG detektiert werden. Periostin-Transkription konnte während der Embryonalentwicklung ab Tag 9 im sich bildenden Herzen sowie ab Tag 10 in den DRG, Knochen, der Lunge und der Leber nachgewiesen werden. In Analysen der rekombinanten Expression in Säugerzellen konnten sowohl sekretiertes als auch intrazelluläres Protein identifiziert werden. Mittels generierter Domänen-spezifischer Antikörper wurde die Expression Periostins auf Proteinebene in DRG?Kulturen sowie in vivo analysiert. Zur exakteren Charakterisierung der Periostin-Expression wurden zudem Sox10-heterozygote und homozygote Embryonen verwendet. Die Analyse von Proliferation und Apoptose in den DRG von Sox10- defizienten Embryonen zeigte, dass die Defekte hier nicht nur auf eine erhöhte Apoptoserate der Zellen, sondern auch auf reduzierte Proliferation zurückzuführen sind. Unter Verwendung der Markerproteine Islet1 und Sox10 konnte die Expression von Periostin in sowohl glialen und neuronalen wie Neuralleistenzellen der DRG belegt werden. Da die Periostin?Expression sowohl in ErbB3- als auch in Sox10?Mutanten nachgewiesen werden konnte, ist die Expression offensichtlich nicht direkt von Sox10 oder ErbB3 abhängig.Proteinstruktur und Expression sowie bisherige biochemische Charakterisierungen von Periostin deuten darauf hin, dass Periostin eine bedeutende Rolle in der Migration und Differenzierung von Schwannzell?Vorläufern zukommen kann.
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