Enzymimmunologischer Nachweis von ''pregnancy-associated glycoprotein'' (PAG) als Hilfsmittel zur Trächtigkeitsdiagnose beim Rind (eBook, PDF)
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Während der Trächtigkeit beim Rind werden in der Plazenta verschiedene Stoffe synthetisiert und durch komplexe Mechanismen an die Mutter abgegeben. Zu diesen Stoffen zählt auch eine Gruppe von sauren Glykoproteinen, den "pregnancy-associated glycoproteins" (PAGs), die in derart großen Mengen gebildet werden, dass sie im Blut und auch in der Milch der Mutter nachweisbar sind und als Indikator für das Vorliegen einer Trächtigkeit genutzt werden können.
Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, ein quantitatives enzymimmunologisches Nachweisverfahren für das bovine PAG-1 zu etablie...
Während der Trächtigkeit beim Rind werden in der Plazenta verschiedene Stoffe synthetisiert und durch komplexe Mechanismen an die Mutter abgegeben. Zu diesen Stoffen zählt auch eine Gruppe von sauren Glykoproteinen, den "pregnancy-associated glycoproteins" (PAGs), die in derart großen Mengen gebildet werden, dass sie im Blut und auch in der Milch der Mutter nachweisbar sind und als Indikator für das Vorliegen einer Trächtigkeit genutzt werden können.
Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, ein quantitatives enzymimmunologisches Nachweisverfahren für das bovine PAG-1 zu etablieren und zu prüfen, ob und ab wann sein Nachweis als sicheres Zeichen einer Trächtigkeit angesehen werden kann. Bei dem enzymimmunologischen Verfahren handelte es sich um einen kompetitiven Test auf der Basis der Doppelantikörpermethode (ELISA). Die Entwicklung des Nachweisverfahrens wurde in folgende Schritte unterteilt:
•Etablierung eines ELISA zu Bestimmung von PAG im Blut
•Adaption des ELISA für den Nachweis von PAG in der Milch
•Erstellung von PAG-Profilen in Blut und Milch trächtiger Kühe
•Prüfung des PAG-ELISA auf Eignung zur Trächtigkeitsdiagnose.
Mit der Etablierung eines spezifischen PAG-ELISA sollte eine Alternative zu den bislang verwendeten radioimmunologischen Nachweisverfahren (RIA) geschaffen werden. Die im ELISA verwendeten PAG-Antiseren, sowie das für die Herstellung eines biotinmarkierten Tracers erforderliche gereinigte PAG waren identisch zu den im RIA verwendeten Stoffen und wurden uns von Prof. Beckers (ULG, Belgien) zur Verfügung gestellt. Die Korrelation von ELISA und RIA wurde anhand 187 Proben ermittelt und lag betrug r=0,96 (p<0,01). Variationskoeffizienten (CV) und Wiederfindungsraten (RR) des ELISA wurden für den Messbereich von 0,4 bis 12,5ng/ml errechnet, nach welchen der ELISA geeignet ist, minimale PAG-Konzentration in einer Milch- oder Serumprobe während der Trächtigkeit nachzuweisen. Der Intraassay-CV des ELISA betrug in Abhängigkeit von der Konzentration 2-14% für Blutserum und 10-12% für Magermilch, der entsprechende Interassay-CV betrug zwischen 8-22% (Serum) und 12-22% (Milch). Die untere Nachweisgrenze beider Assays lag bei 0,4ng/ml.
Zur Darstellung von PAG-Verlaufsprofilen während der Trächtigkeit wurde in regelmäßigen Abständen Blut- und Milchproben von 10 trächtigen Kühen entnommen und ihr PAG-Gehalt mittels ELISA bestimmt. Die erstellten PAG-Profile zeigten den in der Literatur beschriebenen typischen Verlauf, mit einer zunächst stufenweise ansteigenden Konzentration während der frühen Trächtigkeit und einem massiven Anstieg in den letzten Tagen vor der Geburt. Die Konzentration in der Milch wies eine signifikante Korrelation (r=0,81; p<0,01) zu den im Blut gemessenen Werten auf, verlief insgesamt jedoch auf deutlich niedrigerem Niveau, lediglich zwischen 3 und 8% der ermittelten Serum-Konzentration, wonach ein Trächtigkeitsnachweis anhand einer Milchprobe nicht vor dem 150. Tag möglich ist.
Nach der abgeschlossenen Entwicklung des Assays, sollte untersucht werden, ab wann und mit welcher Sicherheit der PAG-ELISA als Trächtigkeitstest beim Rind genutzt werden kann. Hierzu wurden von 400 Kühen eine Blutprobe zwischen dem 20. und 50. Tag nach der Besamung genommen und mittels ELISA analysiert. Der Trächtigkeitsstatus der Tiere wurde anschließend durch rektale oder ultrasonographische Untersuchung oder eine weitere PAG-Probe festgestellt. Für die gemessene PAG-Konzentrationen wurden Tages- und Wochenmittelwerte der untersuchten Tiere berechnet. Ein signifikanter Unterschied (p<0,01; Dunnett-t-Test) in der PAG-Konzentration trächtiger und nicht trächtiger Tiere wurde ab dem 23. Tag, ein hochsignifikanter Unterschied (p<0,001; Dunnett-t-Test) ab dem 28. Tag nach der Besamung nachgewiesen. Nach dem 30. Tag nach der Belegung wurden 94%, ab dem 40. Tag sogar 99% aller Tiere mittels PAG-Test als korrekt trächtig oder nicht trächtig erkannt. Eine mögliche Erklärung für falsch gestellte Diagnosen könnte das Auftreten eines embryonalem Fruchttodes zwischen dem Tag der PAG-Analyse und der späteren Trächtigkeitsuntersuchung der Tiere sein.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der bPAG-1 ELISA eine sichere und verlässliche Möglichkeit zur Messung der PAG-Konzentration einer Milch- oder Serumprobe darstellt und eine Trächtigkeitsdiagnose bei Kühen und Färsen ab dem 30. Tag nach der Besamung anhand einer Serumprobe gestattet.
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